Три вознесенские церкви существовали в разных местах Самары с XVII века, но они последовательно сгорели. После третьего восстановления в 1813 году начали думать о строительстве каменного храма. Всё упиралось в деньги – их нужно было собрать пожертвованиями, а сумма была чересчур большой для маленького прихода. Вознесенские храмы стояли в районе, где было много контор и учреждений, а людей проживало мало – число прихожан уже построенного храма не достигало и 2 000. Из-за нехватки средств на завершающем этапе строительства старую церковь продали буквально на дрова.
Строительство начали в 1841 году, в целом завершили в 1847, но главный иконостас закончили оформлять лишь в 1864 году. Первым освятили правый придел (Михаила Архангельского), затем, в 1848, левый (Пантелеймона Целителя) и главный престол. Очень вовремя – в 1848 и 1850 годах Самару опустошали страшные пожары, в которых уцелели только каменные дома, которых и было-то чуть больше 20.
В конце 1860-х годов материальное положение Собора Святого Вознесения Христова резко улучшилось. Если в 1850-х годах годовой бюджет храма сводился с мизерным в профицитом в 200 рублей при расходах в 4 000, то позже в соборе появляются серебряные и золотые предметы декора. Нигде не упоминаемый денежный ручеёк не пересох и после переноса кафедры. В результате большевики, конфискуя ценности собора, изъяли около 3 пудов (48 кг) одного серебра.
Советская власть закрыла собор в 1930 году. Здание использовалось как склад и постепенно разрушалось, начиная с колокольни и главного купола. Реставраторы, после возвращения храма приходу в 1993 году, фактически построили его заново. Хотя колокольню высотой 56 метров восстановили в 1999 году, вернув храму первозданный вид, окончательно реставрацию завершили лишь во второй половине 2000-х.